치매발병 유전자 BACE 1의 전사조절 메커니즘
저자변정혜
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학위논문사항석사
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발행기관이화여자대학교 대학원
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전공대학원 의과학과
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출판년도2011
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URLhttp://www.dcollection.net/handler/ewha/000000066520
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초 록 목 차 Aβ의 축적으로 생성된 senile plaque는 Alzheimer's disease (AD)를 발병시키는 주요 기전으로 알려져 있다. Aβ는 amyloid precursor protein (APP)이 β-site amyloid precursor protein cleaving enzyme 1 (BACE 1), presenilin (PS 1), presenilin 2 (PS 2)에 의해 분해되어 생성되는 물질로써, BACE 1과 PS 1의 발현 및 활성은 치매환자의 뇌 샘플 및 치매 동물모델에서 연구되어 AD의 발병에 연관되어 있다고 보고되었다.
최근의 연구결과에 따르면, 치매와 치매의 전단계로 알려져 있는 경도인지장애 (mild cognitive impairment, MCI) 환자의 혈액에서 대조군에 비해 현저하게 높은 농도의 homocystein (Hcy)이 발견되었다. Hcy와 그 기질인 SAH는 methionine cycle에 연관되어 있는 매우 중요한 인자로서, 세포 내 DNA 및 히스톤 단백질의 메틸화를 조절한다. DNA와 히스톤 단백질의 메틸화는 전사인자의 활성을 방해하여 유전자의 발현을 감소시키기 때문에, 본 저자는 AD와 관련된 APP, BACE 1, PS 1 유전자가 탈메틸화됨에 따라 발현이 증가될 것이라는 가설을 세웠다.
DNA 메틸화가 이 유전자들의 발현에 관여하는지 알아보기 위해서 본 연구에서는 4가지의 다른 뇌 세포를 이용하여 실험하였는데, 그 세포는 인간 신경모세포종 SH-SY5Y, 생쥐 신경소교세포 BV-2, 인간 성상세포종 U87, 인간 신경소교세포 HMO6이다. 이 세포들에 DNA methyltransferase (DNMT)의 억제제로 잘 알려져 있는 5-aza-2'-deoxycytidine (5-aza-dC)를 처리하였고, 24시간 뒤, RT-PCR과 western blotting analysis를 통해 mRNA 및 단백질의 발현을 측정하였으며, 5-aza-dC를 처리하기 전과 후에 유전자의 promoter와 5'-untranslational region (5'-UTR)의 DNA 메틸화를 비교하기 위해 bisulfite sequencing을 시행하였다. 그리고 5-aza-dC에 의해 탈메틸화가 일어나는 두 CpG가 유전자 전사조절에 관여하는지 알아보기 위해서 본 연구에서는 특정 CpG를 포함한 유전자의 promoter를 luciferase reported gene과 결합한 construct [pGL2-mBACE1 (-1.5kb)]를 제작하였고, 이 construct를 이용하여 promoter의 활성을 측정하였다.
본 연구에서 인간유래 세포주인 SH-SY5Y, HMO6, U87 세포를 이용한 실험에서는 5-aza-dC가 상기 수행한 세 유전자들의 발현에 영향을 주지 못하였지만, 오직 생쥐유래 세포인 BV-2 세포를 이용한 실험에서만 BACE 1의 mRNA와 단백질에서 농도 의존적으로 뚜렷한 발현증가를 발견하였다. 또한, bisulfite sequencing 분석을 시행한 결과에서 5-aza-dC (10µM)를 처리하였을 때 생쥐 BACE 1 유전자 5'-UTR의 두 CpG가 탈메틸화된 것을 알 수 있었는데, in silico 분석을 통해 두 CpG 중 한 CpG는 signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3), CCCTC-binding factor (CTCF) 및 brother of regulator of imprinted sites (BORIS) family 전사인자들이 부착할 수 있는 염기서열 내에 있는 것으로 확인되었다. 게다가 사람과 생쥐의 BACE 1 promoter와 5'-UTR의 상동관계는 약 80%가 일치하지만, 두 CpG는 생쥐의 BACE 1에서만 존재하고 사람의 BACE 1에는 존재하지 않는다.
하지만 기대와는 달리, 인간유래 HEK293-T 세포에 주입하였을 때 정상적으로 luciferase의 발현을 증가시키는 promoter 역할을 하는 [pGL2-mBACE1 (-1.5kb)]를 BV-2 세포에 주입한 뒤 시행한 promoter assay에서는 luciferase 활성을 관찰하는데 실패하였다.
결론적으로, 본 연구에서는 생쥐 BACE 1의 5'-UTR에 존재하는 두 CpG의 메틸화가 BACE 1의 발현에 역할을 할 수 있을 것으로 예상되며, 추후에 두 CpG를 포함한 promoter와 methylation site-free luciferase reporter vector를 결합하여 세포에 주입하는 실험이 필요할 것으로 생각한다.
Ⅰ. 서론 1
A. 알츠하이머병 (Alzheimer's disease) 1
B. 유전적 변화 4
C. 후생유전학적 변형 (Epigenetic modification) 5
1. 후생유전학 5
2. DNA 메틸화 (DNA methylation) 5
3. 히스톤 단백질의 변형 (Histone modification) 7
4. 치매와 후생유전학의 관계 8
D. 본 연구의 의의 10
Ⅱ. 연구대상 및 방법 11
A. 세포 배양 및 약물처리 11
B. Western blotting analysis 11
C. RT-PCR 12
D. Bisulfite sequencing 14
E. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay 16
F. Cloning 17
G. Point mutation 18
H. Transfection 21
I. Luciferase assay 21
J. 통계분석 21
Ⅲ. 연구결과 22
A. SH-SY5Y 세포 내의 탈메틸화에 의한 유전자 발현변화 22
1. Microarray를 통한 후보 유전자 탐색 22
2. Western blotting analysis 25
3. RT-PCR 27
4. Bisulfite sequencing 30
B. BV-2 세포 내의 탈메틸화에 의한 유전자 발현변화 33
1. Western blotting analysis 33
2. RT-PCR 35
3. Bisulfite sequencing 37
4. ChIP assay 39
5. Luciferase 활성측정을 통한 promoter assay 40
C. HMO6 세포 내의 탈메틸화에 의한 유전자 발현변화 44
D. U87 세포 내의 탈메틸화에 의한 유전자 발현변화 46
E. 인간 (human), 생쥐 (mouse), 쥐 (rat)의 BACE 1 염기서열 비교 48
Ⅳ. 고찰 50
참고문헌 54
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